C18反相色譜柱是一種高效液相色譜柱，在藥物分析、環(huán)境監(jiān)測、食品安全檢測等領域有著廣泛的應用。利用反相色譜技術，其原理是表面修飾成疏水性的碳鏈（C18鏈）與待測物通過疏水作用相互作用，實現(xiàn)對待測物的分離和純化。具體來說，C18反相色譜柱內部填充有一定大小和形態(tài)的顆粒，表面涂層有一層碳鏈和疏水基團。樣品在經過樣品預處理后，通過進樣器注入色譜柱中，在柱內填充的顆粒表面發(fā)生反相作用，非極性物質向柱內靠攏，極性物質則排斥柱內顆粒而向外逸散。通過改變流動相的極性和離子強度等條件，可以實現(xiàn)對待測物的選擇性分離和純化。

　　C18反相色譜柱其操作步驟：

　　1、準備工作：

　　檢查儀器設備是否正常運行，確保柱子處于良好狀態(tài)。準備好所需的溶劑和移動相。

　　新柱在使用前需進行處理。配制好65%的乙腈/水溶液，將色譜柱正確連接在色譜儀上，出口放空（注意出口端不可連上檢測器，以免污染），以低流速0.1ml/min~0.5ml/min進行沖洗，等看見柱子出口有液體流出后，過20分鐘再接上檢測器，以循序漸進的方法將流速調至1.0ml/min，繼續(xù)沖洗2~8小時。

　　2、樣品制備：

　　將待測樣品溶解于適當?shù)娜軇┲?，并進行必要的預處理，如過濾、離心等。

　　3、柱子裝填：

　　將C18反相柱裝入色譜柱架中，連接好進樣系統(tǒng)和檢測器。

　　4、初始條件設置：

　　設置移動相組成和流速，一般采用梯度洗脫方法，即開始時使用較弱的極性溶劑，逐漸改變?yōu)檩^強的極性溶劑。

　　5、進樣：

　　將樣品通過進樣系統(tǒng)注入柱中，注意保持穩(wěn)定的進樣流速。

　　6、色譜分離：

　　開始進行色譜分離，根據需求調整流速和梯度條件，使不同組分得到有效分離。

　　7、數(shù)據采集和解析：

　　利用檢測器對柱出口的化合物進行檢測和記錄，獲取相應的色譜圖。

　　8、結果分析：

　　根據色譜圖進行結果分析，確定目標化合物的峰位置、峰高、峰面積等參數(shù)。

　　9、色譜柱清洗：

　　如果樣品分析中只用到一般的乙腈、甲醇和水的流動相，做完樣品后可直接用55%~65%乙腈/水或55%~65%甲醇/水沖洗色譜柱40~80分鐘，然后以純甲醇或乙腈沖洗30分鐘保存。

　　如果樣品分析中流動相里含有緩沖液或酸或離子對試劑，做完樣品后需先用5%的甲醇/水或5%的乙腈/水沖洗一小時以上（如果色譜柱更長，則還需增加適當時間），然后用55%甲醇/~水65%/水沖洗色譜柱30~60分鐘，最后用甲醇或乙腈以1ml/min流速沖洗30分鐘。

　　10、色譜柱再生：

　　當色譜柱使用較長時間后出現(xiàn)柱壓力升高、分離度不好、柱效降低、峰形不好等情況時，可進行再生。先用5%甲醇/水或5%乙腈/水反向沖洗60分鐘以上，然后用四氫呋喃以1ml/min流速沖洗30分鐘以上，再用65%甲醇/水或65%乙腈/水以1ml/min流速沖洗60分鐘，最后用純甲醇或乙腈沖洗30分鐘保存即可。